细菌转录因子 TetR 的高度坚固但可导航的调控环境

转录因子结合位点 （TFBS） 是进化创新的重要来源。通过绘制 TFBS 自适应景观，可以了解进化如何导航此类地点的序列空间。在这样的环境中，单个位置对应于由转录因子结合的 TFBS。该位置的升高对应于序列传递的转录调控强度。在这里，我们开发了一种体内大规模平行报告基因测定法来绘制细菌 TFBS 的景观。我们将该测定应用于 TetR 阻遏物，其已知的 TFBS 很少。我们量化了 17,765 个 TFBS 的转录抑制强度，并表明所得景观...

GAP43 的不稳定变体导致神经发育缺陷

生长相关蛋白 43 （GAP43） 是一种膜相关磷蛋白，主要在神经系统中表达，控制轴突生长、分支和寻路。虽然已经报道了 GAP43 与人类神经系统疾病之间的关联，但其潜在机制在很大程度上仍然未知。我们对一名患有智力障碍 （ID）、神经发育障碍、身材矮小和骨骼异常（如腿部左右差异和手指畸形）的患者进行了全外显子组测序，并确定了 GAP43 基因的杂合错义变异 [NM_001130064.2： c.436G A/p.（E146K）]。变体...

基于可激发的 Ras 动力学筛选显示 RasGEFX 是巨胞饮作用和随机细胞迁移所必需的

真核生物趋化性的兴奋系统可以自发产生 Ras-GTP 富集结构域的不对称信号，以在没有指导线索的情况下驱动随机细胞迁移。然而，负责自发信号产生的分子仍然难以捉摸。在这里，我们通过 Ras-GTP 时空动力学的活细胞成像和分层聚类来表征在盘柄网柄网中编码的 RasGEFs，发现 RasGEFX 主要是自发产生 Ras-GTP 富集结构域所必需的，并且对于与饥饿细胞中的 RasGEFB/M/U 结合的随机迁移至关重要，并且它们对于趋化趋化因...

E2-Ub-R74G 策略揭示了活细胞中 E2 特异性泛素偶联曲线

E2 泛素 （Ub） 偶联酶主要确定 Ub 偶联为 Ub-异肽（赖氨酸）、Ub-氧酯（丝氨酸/苏氨酸）或 Ub-硫酯（半胱氨酸）。然而，细胞内的 E2 特异性 Ub 偶联曲线仍然难以捉摸。在这里，我们开发了融合 E2-Ub-R74G 分析 （FUSEP） 策略，以访问具有氨基酸分辨率的细胞中的 E2 特异性 Ub 偶联曲线。探针特异性亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸修饰的 Ub 残余物能够对非赖氨酸 Ub 偶联进行系统研究，并提供位点特异...

MARTRE 家族蛋白负向调节 CCR4-NOT 活性，以保护 poly（A） 尾长并促进母体 mRNA 的翻译

哺乳动物的早期胚胎发育需要翻译从卵母细胞遗传的母体 mRNA。虽然 poly （A） 尾长会影响卵母细胞到胚胎转化 （OET） 期间的 mRNA 翻译效率，但调节母体 RNA poly （A） 尾长的分子机制尚不完全清楚。在这项研究中，我们确定了 MARTRE，一个以前未表征的蛋白质家族 （MARTRE1-MARTRE6），作为小鼠 OET 期间表达的调节 poly （A） 尾长的调节因子。MARTRE 通过与脱腺苷酶 CCR4-NOT...

正交 RNA 复制在哺乳动物细胞中实现定向进化和达尔文适应

哺乳动物细胞的定向进化为推进合成生物学应用提供了一种强大的方法。然而，现有的基于哺乳动物的定向进化方法面临巨大的瓶颈，包括宿主基因组干扰、小文库大小和不受控制的诱变。在这里，我们设计了一个正交的 α 病毒 RNA 复制系统来进化基于 RNA 的设备，从而在增殖的哺乳动物细胞中实现 RNA 复制酶辅助连续进化 （REPLACE）。该系统通过复制酶限制的复制和诱导诱变模式产生一个大型的、连续多样化的复制 RNA 文库。使用 REPLACE，...

SYK 融合激酶中 N 末端区域的差异调节作用揭示了 ITK-SYK 独特的激活诱导核转位

ITK-SYK 和 TEL-SYK（也称为 ETV6-SYK）是人致瘤嵌合蛋白，分别包含 SYK 的激酶区和 ITK 的膜靶向、N 末端、PH-TH 结构域双峰或 TEL 的二聚化 SAM-PNT 结构域。ITK-SYK 导致外周 T 细胞淋巴瘤，而 TEL-SYK 见于骨髓增生异常综合征。BTK 是一种与 ITK 高度相关的激酶，为了进一步描述 N 端的作用，我们生成了相应的融合激酶 BTK-SYK。通过生成和分析这些融合激酶，我们旨...

琼脂糖水凝胶介导的电穿孔方法，用于在气液界面培养的视网膜组织

在气液界面培养离体视网膜和其他组织以实现更有效的气体交换是有利的。然而，将基因递送到这些培养物可能具有挑战性。电穿孔是一种快速而稳定的基因递送方法，但通常需要浸没在液体缓冲液中以使电流流动。我们开发了一种无浸没电穿孔技术，该技术在正电极和视网膜之间包含一个琼脂糖水凝胶盘。在长时间培养后，视网膜内神经元和 Müller 胶质细胞转染的倾向增加。我们还观察到电刺激后 BrdU 在 Müller 胶质细胞中掺入的增加，以及从具有不同启动子的表...

通过连续微流控电穿孔芯片扩大 CRISPR/Cas9 基因编辑的细胞数量

CRISPR/Cas9 介导的基因编辑为多种疾病提供了有前途且安全的治疗选择。在短时间内有效获取大量基因编辑治疗细胞的技术难题阻碍了 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑的广泛临床应用。在此，已经开发了一种大容量连续电穿孔芯片 （LaViE-Chip） 来应对获取足够数量的基因编辑细胞用于 CRISPR/Cas9 基因编辑的挑战。通过并联多个相对较窄的微流体通道，两个简单的片外电极在细胞流体积和电场均匀性之间实现了令人满意的平衡，这也...

合成的固有无序蛋白质融合标签，可增强蛋白质溶解度

我们报道了小 （20 kDa） 和高可溶性合成固有无序蛋白 （SynIDP） 的从头设计，这些蛋白赋予融合伴侣溶解度，而对融合蛋白活性的影响最小。为了鉴定高度可溶的 SynIDP，我们利用一锅法基因合成技术创建了一个混合基因文库，以创建一个编码 SynIDP 的大型重复基因文库。我们从该基因文库中鉴定了三个小 （20 kDa） 和高可溶性 SynIDP，它们缺乏二级结构且具有高溶剂化。这些 SynIDP 与三种已知包涵体形成蛋白的重组融...

肝 SerpinA1 通过调节前脂肪细胞增殖和 UCP1 表达来改善能量和葡萄糖代谢

脂肪代谢障碍和肥胖与胰岛素抵抗和代谢综合征有关，并伴有脂肪组织失调。在这里，我们表明，在小鼠脂肪细胞特异性胰岛素信号丢失引起的脂肪代谢障碍中恢复期间，肝脏中的丝氨酸蛋白酶抑制剂 A1 （SerpinA1） 表达增加。SerpinA1 诱导白色和棕色前脂肪细胞的增殖，并增加解偶联蛋白 1 （UCP1） 的表达，以促进成熟白色和棕色脂肪细胞中的线粒体活化。肝脏特异性 SerpinA1 转基因小鼠表现出脂肪组织褐变增加，导致能量消耗增加、肥胖...

信号素 3A 排斥指导发育中的鸡脑中先锋纵向轴突的尾部投影

内侧纵束 （MLF） 是在腹侧脊椎动物大脑中发育的第一个轴突束。它起源于间脑，向尾部投射到脊髓中，为后来的轴突发育开辟了道路。先前对鸡的解剖学和表达分析表明，信号素 3 A （Sema3A） 是排斥前脑羊膜 MLF 的候选者。然而，对斑马鱼的研究表明，一种远亲信号素在轴突肌束形成中发挥作用，而不是引导。因此，解释 MLF 尾部投影的机制仍不清楚。在这里，我们表明 Sema3A 的错误表达或表达 Sema3A 的细胞移植到 MLF 的路径...