选择氨酰基-tRNA 合成酶/tRNA 对，将非经典氨基酸高效遗传编码为蛋白质

遗传密码扩展应用的一个关键组成部分是氨酰基-tRNA 合成酶 （RS）/tRNA 对，它忠实地编码响应特定密码子的非经典氨基酸 （ncAA）。在这里，我们详细介绍了从公开可用的 320 万成员甲甲基嗜碱碱 alvus pyrrolysyl-RS （马PylRS） 活性位点突变体库中选择 ncAA 特异性 RS 的程序。该过程的四个主要部分是：（1）准备文库以供使用并创建所需的细胞系;（2）分别选择功能性RS和选择包含经典氨基酸的RS的生死选择;（3）三个基于荧光的状态检查，提供有关存活RS掺入目标ncAA的效率和保真度的信息;（4） 表征热门点击以找到最适合应用的热门点击。由此产生的 RS/tRNA 对可用于细菌或真核细胞来研究感兴趣的蛋白质。此外，马PylRS 的稳定性使其可用于无细胞 ncAA 蛋白表达，并适用于结构和其他体外表征。该协议可供具有基本分子生物学专业知识的人使用，并具有可靠的阳性对照方案进行选择，在不同阶段进行状态检查以解释成功水平，以及表征新设计的tRNA-RS对的稳健程序。该协议的用户有望在大约 30-50 天内从文库中选择 ncAA 特异性 RS/tRNA 对，具体取决于制备需要。

原标题：Selecting aminoacyl-tRNA synthetase/tRNA pairs for efficient genetic encoding of noncanonical amino acids into proteins

通讯作者：Richard B. Cooley & Ryan A. Mehl

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